|
|
09 Nisan 2021, 11:40
|
#1 |
  |
Yardimci Ureme Sistemlerinde Proteomik Numune Hazirlama Ve Yetistirme
Embriyo kultivasyon ortami genellikle IVF proseduru sirasinda atilir, ancak coklu teshis ve prognostik prosedurler icin kullanilabilir. Kesinlikle, etik, ahlaki yonergeler ve prosedurlere uyulmali ve etik kurul veya diger ilgili kuruluslar bu materyalin kullanimini onaylamalidir. Bu konuda yapilan deneyler, Viyana’daki Tip Universitesi ve Avusturya‘daki Linz Universitesi’nin etik kurullarindan onay alinarak IVF ortamindan yetistirme ortamlari kullanilarak gerceklestirilmistir. Ornekler, embriyo gelisiminin farkli asamalarinda toplandi ve dusuk ornek miktarlarinin analizi icin olusturulan yontemler kullanilarak analiz edilmektedir.
Proteomik Numune Hazirlama Protein sindirimi icin tripsin, Promega Inc.’den (Viyana, Avusturya) satin alindi. HPLC icin cozuculer – metanol (MeOH), asetonitril (AcN), 2,2,2-trifloroetanol (TFE), formik asit (FA), heptaflorobutirik asit (HFBA), iyodoasetamid (IAA), trietilamonyum bikarbonat (TEAB) ve ditiotreitol —Sigma-Aldrich’ten (Viyana, Avusturya) satin alinmistir. Embriyo yetistirme ortamini analiz ederken en onemli adimlardan biri, bu orneklerde bulunan serum albumininin tukenmesidir. Tarasova vd., kucuk ornek hacimlerinin tukenmesi icin immobilize anti insan albumin antikorlarinin kullanilmasina yonelik yenilikci yontemi acikladi. Kisaca, secilen embriyolardan kultur ortami orneklerinin tukenmesi icin numune, 0.01 M fosfat tamponu, 0.0027 M KCl ve 0.14 M NaCl’den olusan fosfat tamponlu salin tamponu (pH 7.4) kullanilarak seyreltildi. Bu tampon ayrica numune yuklemesi uzerine yikama tamponu A olarak da kullanilmistir.Yardimci Ureme Sistemlerinde Proteomik Numune Hazirlama ve Yetistirme Tukenme kolonundan tam numune geri kazanimini saglamak icin, tampon B olarak Agilent (pH 2.25) (Agilent Technologies, CA, ABD) ‘den kullanima hazir bir elusyon tamponu kullanildi. Tukenmesi icin yeni bir kolon gelistirdik. antihuman albumin antikorlarini monolitik destek diskine, ozellikle IVF numunelerinde de olusan kucuk numune miktarlarinin analizi icin CIMac-HSA kolonuna sabitleyerek insan albumini. Bu kolon, 0.3 mL / dakikalik bir kolon akis hiziyla albumin tukenmesi icin bir ICS-5000 inert HPLC sisteminde (Dionex-Thermo Scientific, Germering, Almanya) kullanilmistir. Numune enjeksiyonu uzerine, yukleme ve yikama tamponu A, 5 dakika boyunca kolondan pompalandi ve akis fraksiyonu toplandi (V = 350 uL). Bu fraksiyonlarin hacmi, tam absorbans zirvesine karsilik gelir ve kolon uzerinde hapsolmamis tum proteinleri icerir. Albumin, kolonun yuzeyindeki antikorlarla etkilesim tarafindan tutuldu ve ayristirilan mobil fazin miktari 5’ten 10 dakikaya cikarilarak ayristirildi. Sutun, son olarak, 4 dakika daha yukleme tamponu A ile yikandi ve bu asamayi, tampon B ile ilave bir yikama asamasi ve son olarak, 13 dakika sureyle yeniden yukleme tamponu A kullanilarak dengeleme asamasi izledi. Bu tukenme protokolunu tamamlamak icin toplam sure, 0,3 mL / dak kolon akis hizi uygulanirken 30 dakikadir. Bu sure boyunca, cok onemli kolon yikama adimi ve bir sonraki tukenme calismasindan onceki kolonun tamamen yeniden dengelenmesi gerceklestirilir. Kullanilan akis hizi, proteinin etkilesim suresini maksimize etmek icin secildi ve islemin hizi ve etkinligi arasinda bir uzlasmaydi. Istenirse, daha yuksek kolon akis hizlari, kolonun performansinin cogunu kaybetmeden kullanilabilir. Kullanilan akis hizi, proteinin etkilesim suresini maksimize etmek icin secildi ve islemin hizi ve etkinligi arasinda bir uzlasmaydi. Istenirse, daha yuksek kolon akis hizlari, kolonun performansindan fazla bir sey kaybetmeden kullanilabilir. Kullanilan akis hizi, proteinin etkilesim suresini maksimize etmek icin secildi ve islemin hizi ve etkinligi arasinda bir uzlasmaydi. Istenirse, daha yuksek kolon akis hizlari, kolonun performansindan fazla bir sey kaybetmeden kullanilabilir, ancak bu dikkatlice incelenecek ve optimize edilecektir. Hem toplanan fraksiyonlardaki hem de tukenmemis orneklerdeki proteinler, tripsin ile standart bir protokol kullanilarak tuketildi. Toplanan fraksiyonlarda yuksek konsantrasyonda fosfat tamponu nedeniyle, 50 mM TEAB nihai konsantrasyonuna ulasmak ve fosfat tamponunu seyreltmek icin fraksiyonlara 1 M trietilamonyum bikarbonat (TEAB) ilave edildi. Protein denaturasyonu icin, 50 m MTEAB icinde 10L% 0.1 (w / v) Rapigest tum fraksiyonlara eklendi ve disulfid baglarinin indirgenmesi, ditiyotreitol (5 mM DTT nihai konsantrasyonu) kullanilarak ve reaksiyon karisimi 30 dakika sureyle 60 ° C’de inkube edilmistir. Basarili bir tripsinizasyon icin, alkilasyon, 15 mM IAA nihai konsantrasyonda iyodoasetamid kullanilarak gerceklestirildi. IAA ilave edildikten sonra, numune oda sicakliginda karanlikta 30 dakika inkube edildi. Fazla iyodoasetamid, tripsin etkisini inhibe ediyor ve notralize edilmesi gerekmektedir; bu, 50 mM TEAB icinde 2 L 50 mM DTT eklenerek ve 2 dakika boyunca oda sicakliginda kuvvetli bir sekilde karistirilarak elde edildi. Son olarak, 10L 0.2 g/L tripsin solusyonu eklenmis ve numuneler bir inkubasyon firininda 37 ° C’de 16 saat inkube edilmistir. Triptik aktivite, solusyonun % 1 TFA solusyonu ile asitlestirilmesiyle durduruldu. LC – MS / MS analizi icin, 20 L sindirilmis ve seyreltilmis ornek (2: 3 (v / v) oraninda sulu% 0,1 TFA) LC – MS / MS analizi icin enjekte edilmistir. Kromatografik Ayirma ve Kutle Spektrometresi Algilama Triptik peptidlerin nanoHPLC ile ayrilmasi icin bir Dionex UltiMate 3000 RSLC nanoLC sistemi (Dionex-Thermo Scientific) kullanilmistir. Triptik peptidlerin kromatografik ayrilmasi icin kullanilan mobil fazlar asagidaki gibiydi: (A) sulu % 0.1 formik asit icinde % 5 asetonitril ve (B) metanol, trifloroetanol, su ve asetonitril (30: 10: 10: 50 (h / h / v / v) ve % 0.1 formik asit). Numune, kalinti tuzlarinin yikanmasi ve 3 ° C’ye sogutulmus% 0.1 sulu TFA’dan olusan mobil faz yukleme kullanilarak kucuk bir numune olarak onden analitlerin odaklanmasi icin tuzak kolonuna yuklenmistir. 75 dakikalik toplam calisma suresinin dogrusal olmayan gradyani, triptik peptitlerin HPLC ayirmalari icin kullanildi. Gradyan, sirali dogrusal adimlar kullanilarak olusturulmustur: • 7 dakika icin % 1.0 B min- 1 . • 38 dakika icin % 0.5 B min- 1 gradyan. • % 1.5 B min – 1, 20 dak. • 10 dakika icin % 3.0 B min -1 HPLC akisi, maXis Impact UHR TOF kutle spektrometresine (Bruker Daltonics, Bremen, Almanya) dahil edildi ve LC-MS / MS analizi, her numune icin uc kez gerceklestirilmistir. Peptit parcalanmasi (MS / MS) icin, carpismanin neden oldugu ayrisma kullanildi ve tum MS / MS verileri, aletin parametrelerinin daha fazla optimizasyonu yapilmadan uc saniyelik bir dongu kullanilarak 300-2000 m / z araliginda elde edildi. Dusuk yogunluklu iyonlarin gereksiz parcalanmasini onlemek icin oncu iyonlar icin alt esIk 1000 sayima ayarlandi. Bazi peptidlerin kuyruklanmasi ve sIk sIk gozlemlenen piklerin birlikte elusyonu nedeniyle, dinamik bir dislama kullanildi ve sure 120 saniyeye ayarlandi. Oncu iyonun 120 saniyelik dislama suresinden sonra daha yuksek yogunluk gostermesi durumunda, ilave bir MS / MS olayi icin yeniden degerlendirilmistir. Protein tanimlamasi icin veri tabani arastirmasi, tum taksonomi Swiss-Prot veri tabani kullanilmistir. Bu arama icin X Asagidaki parametrelere sahip Tandem kullanilmistir: • Oncu kutle toleransi ± 10 ppm’dir. • ± 0.3 Da’lik parca kutle toleransi. • Maksimum iki gozden kacan bolunmeye izin verilmistir. Numune hazirlanmasina ve biyolojik sureclere bagli olarak peptitlerin bazi posttranslasyonel modifikasyonlari beklenebilir. Tarif edilen deney icin, sabit modifikasyon ve metiyonin oksidasyonu olarak sistein karbamidometilasyon secilmistir. Serin, treonin ve tirosin tortularinin fosforilasyonunun yani sira lizin ve N-terminal tortularinin asetilasyonu, degisken modifikasyonlar olarak secilmistir. Veri Analizi Yardimci Ureme Sistemlerinde Proteomik Numune Hazirlama ve YetistirmeAciklanan deneyler icin tum veri analizleri Tarasova ve digerleri tarafindan aciklanan yontem kullanilarak analiz edilmistir. Pyteomics.pepxmltk donusturucunun kullanimi (ve arama baska bir yerde aciklanmistir. Kisaca, bu platform X’i donusturmek icin kullanilmistir. Tandem dosyalari standart pep.xml formatinda ve veri analizi gerceklestirilmistir. Veri tabani arastirmasi uzerine tum tanimlamalar, peptit seviyesinde % 1.0 FDR gereksinimini karsilamak icin suzuldu. Arama sonuclari, daha once tarif edilen MPscore yazilimi kullanilarak bir arama sonrasi dogrulama icin gonderilmistir. Belirlenen proteinler ile ilgili kantitatif bilgi, biyolojik numuneler arasinda farkliliklari belirlemek icin onemli bir gereklilik oldugunu, ve kimlik ve dogrulama gereklerini yerine getiren tum proteinler normallestirilmis spektral indeksi (SIN) olarak adlandirilan etiket icermeyen kantitatif bir yaklasim (Griffin ve dig.) kullanilarak nicellestirilmistir. IVF Yetistirme Ortaminda Albumin Tukenmesi Kultivasyon ortaminda albuminin varligi, embriyolarin normal gelisimi icin gereklidir. Bununla birlikte, varligi proteomik analiz icin onemli bir yuktur ve ileri analiz adimlarindan once kaldirilmasi gerekir. Albuminin cikarilmasi kapsamli bir sekilde tartisilmis ve bir dizi yayinda aciklanmistir. Farkli gruplar, bagisIkligi azaltan kromatografi, molekuler agirlik kesme filtreleri, peptit kitapliklari, boyut dislama kromatografisi, vb. Gibi bir dizi yontem kullanmistir. Tum bu yontemlerin bazi avantajlari vardir, ancak ayni zamanda dezavantajlari da vardir. Albuminin IVF yetistirme ortamindan tukenmesi durumunda, cok dusuk numune hacmi (maksimum 40 l) dikkate alinmalidir. Ayrica, hangi dollenmis oositin once aktarilacagina ve hangilerinin dondurulacagina karar vermeye yardimci olacak klinik numunelerin hizli analizi icin kullanilmasi amaclaniyorsa, tukenme yontemi hizli bir sekilde gerceklestirilmeli ve cok sayida numunede tekrarlanabilir olmalidir. Bu calismada, HSA’nin (CIMac-HSA) tukenmesi icin yeni bir immunoafinite tabanli konvektif etkilesim ortam analitik sutunlarinin (CIMac) kullanimi gerceklestirilmistir, ve dakika numune miktarlarindan hizli ve tekrarlanabilir albumin tukenmesi icin kullanilabilecegini kanitlamistir. Kolonun mimarisi ve konvektif akisli kolonlarin kanallari akis hizindan bagimsiz bir baglama kapasitesi ve mukemmel kromatografik cozunurluk saglar. Bu ozellikler, CIMac-HSA kolonuna, klinik kullanim icin olaganustu onemli bir parametre olan silika bazli kolonlar kullanilarak albuminin genel kromatografik tukenmesine kiyasla analiz suresinin kisaltilmasi gibi bazi onemli analitik faydalar saglar. Yetistirme ortaminin farkli partilerindeki albumin icerigi buyuk olcude farklilik gosterir ve ayni zamanda farkli tedarikciler arasinda buyuk olcude farklilik gosterir. Bu nedenle tukenme yontemi, cesitli ornekler icin uygulanabilecek bir sekilde secilmelidir. Secilen yontemlerden bagimsiz olarak, embriyo transferi uzerine iki ortamin ayrilmasi icin iki SDS-jel seridini gostermektedir. Albumin farkli donorlerden geldiginden ve uretim sahasinda karistirildigindan, kesinlikle gelismekte olan embriyodan salgilanan proteinlere mudahale edebilecek bir dizi baska protein icerecektir. Ayrica salgilanan proteinler albumine baglanabilir ve bu nedenle proteomik analiz icin gorunmez olabilir. Iki farkli tukenme kolonunda kultur ortami orneklerinde albumin tukenmesi gerceklestirdikten sonra albuminsiz fraksiyonlarda proteinler ve bunlarin nispi miktarlari tanimlanmiustir. CIMac-HSA FT’de veya Seppro FT1 fraksiyonlarinda tanimlanan proteinler, B ve S ve ardindan Swiss-Prot protein ID ile etiketlenir. Normallestirilmis spektral indekslerin (SI) medyan degerleri ve standart sapmalar gosterilir. Tukenmemis orneklerdeki medyan SIHSA kirmizi cizgilerle isaretlenmistir. Tarasova ve digerlerine gore listelenen proteinlerin her biri icin ikiden fazla peptit-spektrum uyumu varsayilmistir. Arastirmaci Dyrlund vd. kosullandirilmamis ticari embriyo kultur ortaminin analizini gerceklestirmis ve toplam 5 mL ortamin tukenmesi ve sindirilmesi uzerine bir dizi protein tanimlamistir. Bununla birlikte, gercek IVF islemi sirasinda ornekler alinirsa 5 mL miktari hicbir zaman mevcut olmayacaktir. Bununla birlikte, bu analiz, bu miktarin sasirtici miktarda 25 mg albumin icerdigini gostermktedir. Burada, albumine ek olarak farkli ortam gruplarinda farkli konsantrasyonlara sahip toplam 111 protein tanimlandi. Kosullandirilmamis ortam numunesi ayrica onceden embriyonik canliligin olasi belirtecleri olarak onerilen sekiz proteini, ornegin proteoglikan-4, serotransferrin, vitamin-D baglayici protein, ubikitin, vb. Icermektedir. IVF ortami uzerinde yapilan baska bir calisma, partiden partiye varyasyonlari inceledi ve hem protein miktarlarinda hem de protein tanimlamalarinda varyasyonun beklenebilecegini gostermektedir. Bu medyayi incelerken, gecerli bir karsilastirma yapabilmek icin hem medyanin, hem de kontrolun hem de embriyolarin buyudugu medyanin ayni partiden olmasi gerektigine dikkat etmek onemlidir. Kullanilmis IVF ortami, IVF’de varsayilan biyobelirtecler olarak kullanilabilen proteinler icin degerli bir kaynaktir. Arastirmacilarin ana odak noktasi, salgilanan proteinler olmustur, ancak ortamda zaten mevcut olan proteinler esit derecede degerli olabilir ve embriyolarin kalitesi biyobelirteclerinin pesinde dusunulmelidir. Ortamda halihazirda mevcut olan proteinlerin embriyo gelisimi icin gerekli olabilecegi ve spesifik proteinlerin alimi veya degradasyonu, embriyo gelisimi veya bunun eksIkliginin kesinlesmesi ile iliskili olabilir. Bu nedenle, bu ortamlar, embriyolarin basari oranlarini ayirt etme ve potansiyel biyobelirtecler olabilecek proteinleri izleme potansiyelleri acisindan degerlendirilmelidir. Ek olarak, bu proteinlerin yavrular icin kultur ortamindaki guvenligi de degerlendirilmelidir. IVF Yetistirme Ortamindaki Proteinlerin Belirlenmesi Yardimci Ureme Sistemlerinde Proteomik Numune Hazirlama ve YetistirmeArastirmacilar tarafindan tanimlanan proteinler. Katze-Jaff tarafindan bireysel olarak kulturlenmis insan embriyolarinin sekretomunun analizi uzerine rapor edilmistir ve bu proteinlerin embriyonun morfolojisi ve dolayisiyla yasayabilirligi ile iliskili olabilecegi konusunda bir ipucu yapilmistir. Dejenere olan blastositlere kiyasla blastositlerin gelismesinde ubikitinin yukari regule edildigini bildirmislerdir. Bununla birlikte, ubikitin yukari regulasyonu ile gozlenen gebelik oranlari arasinda hicbir korelasyon yoktur. Cortezzi vd. hem pozitif hem de negatif embriyo gruplarinda, yani transfer icin canli olarak adlandirilan ve secilmeyen embriyolarda proteinlerin tanimlandigini bildirdi. Pozitif implantasyon grubu icin Jumonji (JARID2) adi verilen protein bildirildi. Bu protein, bircok embriyonik modelleme genini susturmak icin kromatin metilasyonu modifiye eden ve hucre proliferasyon sinyallemesinin negatif bir duzenleyicisi olarak gorev yapan, polikomb baskilayici kompleks 2 (PRC2) adi verilen bir histon metiltransferaz kompleksi olusturur. Bu, hucre kaderlerinin gelisimi, farklilasmasi ve surdurulmesi icin gerekli olan uygun bir hucre populasyonuna sinirli bir gen ekspresyonu ile sonuclanir. Ayni calismada, testise ozgu gen 10 proteini (TSGA10) yalnizca negatif orneklerde tanimlanmistir. TSGA10, perinukleer bir proteindir ve fare embriyolarinda aktif olarak bolunen ve fetal farklilasan dokulara katildigi tarif edilmistir. Katz-Jaffe vd. heparin baglayici epidermal buyume faktoru EGF benzeri buyume faktoru onculunun (HB-EGF) tanimlanmasini bildirmislerdir. Bu buyume faktoru oncusu, EGF ailesi buyume faktorlerine aittir ve membrana sabitlenmis formda (proHB-EGF) ve cozunur formda (sHB-EGF) bulunur. Cozunur form, hucre disi alanda proHB-EGF’nin proteolitik bolunmesinden uretilir. Ayrica, cozunur HB-EGF’nin bir buyume uyaricisi oldugu gozlemlenmistir ve serumsuz ortama eklendiginde blastosist gelisimini ve cikimini onemli olcude iyilestirir. Bununla birlikte, bir in vitro model sistemden yapilan diger calismalar, proHB-EGF’nin buyume aktivitesini inhibe eden bir jukstakrin mekanizma ile hucreden hucreye sinyallemede islev gorebilecegini gostermektedir. Bu protein dejenere olan blastositlerde tanimlandigindan, yukari regulasyonu daha fazla gelisme olmamasina katkida bulunabilir. Maternal uterin epitelinin kontrollu bir trofoblastik istilasi icin basarili memeli implantasyonu icin sistatin benzeri bir oncu gereklidir. Bu istila cesitli proteinazlar tarafindan uterus matriksinin ekstraseluler degradasyonunu icerdiginden ve onemli olanlardan biri sistein proteinazlar oldugu icin mevcut ve islevsel olmalidir. Sistatinlerin, sistein proteinazlari inhibe ettigi bilinmektedir ve bunlarin yukari regulasyonu, buyuk olasilikla dejenere blastosistlerin implantasyonunun basarisizligina katkida bulunacaktir. Bu nedenle, sadece bu proteinleri, olasi biyobelirtecleri tanimlamak degil, ayni zamanda bu bulgulari insanda dogrulamak da onemlidir. ALİNTİ ~
________________
Bizde Mutsuz Olalim ~
|
|
|
|
12 Nisan 2021, 22:01
|
#2 |
  |
Emeğine sağlık
|
|
|
|
30 Eylül 2022, 22:25
|
#3 |
  |
bi nevi hazirlama yani
________________
No MoRe DramA
|
|
|
| Konuyu Toplam 1 Üye okuyor. (0 Kayıtlı üye ve 1 Misafir) | |
|
|
Normal
