|
|
21 Ağustos 2020, 09:29
|
#1 |
  |
Gen Nakavti Yontemi
Gen nakavti; bir geni cikararak, hucre veya organizma uzerindeki etkileri gozlemleyerek genlerin islevini incelemek icin kullanilan molekuler biyoloji yontemidir. Geni tamamen silerek, gene mutasyonlar sokarak, genin ekspresyonunu baskilayarak veya olgun organizmada geni duzenleyerek basarilabilir.
Gen Nakavt Yontemleri Yapay gen nakavt organizmasini olusturmak icin, ilgilenilen geni susturmak veya cikarmak icin birkac yontem kullanilir. Gen nakavt yontemleri sunlardir: • Gen susturma • Kosullu nakavt • Homolog rekombinasyon • Gen sonu • Mutasyona gore nakavt Mutasyon ile Gen Nakavt Mutasyon yoluyla gen nakavt genellikle bakterilerde gerceklestirilir. Bu teknigin Escherichia coli’de kullanilmasinin erken bir ornegi 1989 yilinda Hamilton ve arkadaslari tarafindan uygulanmistir. Bu deneyde, geni silmek icin iki ardisIk rekombinasyon kullanilmistir. Bu calisma, bakterilerdeki fonksiyonel bir genin cikarilmasi veya degistirilmesinin fizibilitesini olusturmustur. Bu yontem o zamandan beri diger organizmalar, ozellikle de fareler gibi arastirma hayvanlari icin gelistirilmistir. Nakavt fareleri, hastalik icin onemi olabilecek insan esdegerlerine sahip genleri incelemek icin yaygin olarak kullanilmaktadir. Nakavt fareleri kullanan bir arastirmanin son ornegi, Ani Aciklanamayan Gece Olum Sendromunda (SUNDS) Xirp proteinlerinin ve Cin Han Populasyonunda Cheng ve arkadaslarinin Brugada Sendromundaki rollerinin arastirilmasidir . Arastirmacilar, iki sendromlu kisilerde Xirp genlerini taradilar ve patojenik olabilecek iki gen varyanti belirlediler. Xirp2 nakavt fareleri kullanarak, Xirp2 icermeyen fare kalplerinin bir takim anormalliklere sahip oldugunu ogrenmislerdir. Bu calisma, SUNDS ve Brugada sendromunda rol oynama olasiligi bulunan Xirp varyantlarinin tanimlanmasina ve Xirp2’nin kalp fonksiyonundaki rolunu ortaya koymasina izin vermistir. Gen Susturma Gen susturma veya RNA etkilesimi (RNAi), gen nakavt calismalari icin populer hale gelen daha yeni bir teknolojidir. RNAi’de, belirli bir gen icin haberci RNA’yi inaktive etmek icin kucuk karisan RNA (siRNA) veya kisa sac tokasi RNA (shRNA) kullanilmaktadir. Bu, gen ekspresyonunu etkili bir sekilde bastirir. RNAi kullanilarak gen susturulmasi, Bcl-2 ve p53 gibi onkogenlerin yani sira norolojik hastalik, kalitsal bozukluklar ve viral enfeksiyonlarda yer alan genleri hedeflemek icin kullanilmistir. Kosullu Nakavt Gen silinmesini kullanan nakavt yontemleri, erken gelisimde yer almayan genleri incelemek icin guclu olmustur. Bununla birlikte, erken gelisim sirasinda aktif olan genler, organizmaya oldurucu bir etki olmaksizin genellikle elenemez. Kosullu nakavt bunun ustesinden gelmenin bir yoludur. Orijinal kosullu nakavt yontemi, LoxP olarak bilinen kisa hedef sekanslari yeniden birlestiren Cre adi verilen bolgeye ozgu bir rekombinaz kullandi. O zamandan beri baska rekombinazlar gelistirildi ve sartli nakavt calismalari icin kullanilmistir. Onceki yontemlerden ikisini birlestiren Kuhn, et al RNA’sinin (shRNA) ekspresyonunu kontrol etmek icin Cre rekombinaz veya doksisIklin kullanilarak farelerde gen susturulmasinin induklenmesi icin bir 2010 makalesinde bir yontemi tarif eder. Yontem, demonte farelerin tekrarlanabilir uretimi ile sonuclanmistir. Gen Duzenleme Cinko parmak nukleazlari (ZFN’ler), transkripsiyon aktivatoru benzeri efektor nukleazlar (TALEN’ler) ve duzenli araliklarla kumelenmis kisa palindromik tekrar (CRISPR) gibi gen duzenleme sistemleri, bolgeye ozgu rekombinazlara karsi ortaya cikan bir alternatiftir. Bu enzimler, klonlama gibi molekuler biyolojide bircok temel yontemin yerini almaya baslamistir. Kosullu gen nakavt, orijinal araclara gore bazi avantajlara sahip olduklari baska bir ornektir. Gen Nakavt Sureci Gen nakavt yonteminde bazi surecleri takip edilmesi gerekir. Bu surecler su sekildedir: Nakavt icin bir gen secme: Genetik muhendisligi deneylerinin herhangi birindeki ilk adim, hedefi secmektir, burada hedef, calismak veya islevini anlamak istenilen bir gendir. Bundan sonra, ilgilenilen genle ilgili yapi, uzunluk ve diger parametrelerin calisildigi bazi kuru laboratuvar calismalari yapilir. Buna dayanarak, deney icin en uygun plazmid secilir. Ancak bundan once, ilgilenilen gen tanimlanir ve bir kromozom uzerinde haritalanir. Vektor yapimi: Vektor, ilgilenilen gen veya baska herhangi bir DNA dizisini hedef hucrelere transfer etmek icin kullanilan bir aractir, bunun icin genellikle bir plazmid kullanilir. Plazmid, genetik muhendisligi deneyleri icin kullanilan bir bakterinin kromozom disi DNA’sidir. BAC- bakteriyel yapay kromozom vektoru, gen nakavt deneyleri icin kullanilir. DNA dizisine, protein olusumunu engelleyen bir cerceve kaymasi mutasyonu eklendigi varsayalim. Bazi ORF’ler yani acik okuma cercevelerini genden cikarilmasi ve degistirilmis bir geni BAC’ye yerlestirilmesi islemidir. Bu sekilde daha guvenli bir sekilde, sonuclari dogrulamak icin bir isaretci DNA dizisi de eklenir, genellikle bunun icin bir antibiyotik direnc geni kullanilir. Bununla birlikte, replikasyonun orijini, promoter sekansi ve tanima sekanslari gibi diger onemli DNA sekanslarindan bazilari da plazmide eklenir. Artik plazmidi donusume hazirdir. ES hucrelerine yerlestirme: Simdi elektroporasyon, sonikasyon veya mikroenjeksiyon gibi yapay yontemler kullanarak, plazmidi ES hucrelerine yerlestirilir. Embriyonik kok hucreler daha hizli bolunebilir ve her tur hucreye bolunebilir. ES hucreleri, olgun fare dokularina donusme gucune sahiptir. Elektroforasyon yontemi, elektrik akimi altinda hucreye bir genin yerlestirildigi bilim adamlari tarafindan gen nakavtinda kullanilan en iyi tekniklerden biridir ve artik e ES hucreleri plazmidi hedef hucrelerinicindedir. Hedef geni bulursa, rekombinasyon meydana gelir ve hedef gene bir mutasyon eklenir. Ayrica bir isaretleyici gen dizisi kullanilir, boylece mutant gen dizisi ile birlikte, isaretleyici gen dizisi de donusturulmus hucrelerin genomuna eklenir. Simdi donusturulmus hucrelee neomisin iceren ortama buyutuluyor, boylece NeoR genini iceren hucreler buyuyebiliyor. Ve NeoR iceren hucreler ile NeoR geni olmayan hucreler arasinda ayrim yapilabilir. Ek parcanin onaylanmasi: Hucreler in vitro kosullar altinda buyuttutuldugunde, bazi hucrelerin donusturulmesi veya bazi hucrelerin donusturulmemesi mumkundur. Simdi, polimeraz zincir reaksiyonu kullanilarak, ek dogrulanabilir. Bunun icin DNA, kulturlenmis hucrelerden ekstrakte edilir. Isaretleyici DNA dizisine ozgu bir dizi primer, amplifikasyonun basarilmasi icin kullanilir. Amplikonlar gozlenirse hucreler donusturulur, aksi takdirde deneyimiz basarisiz olur. ES hucrelerinin basarili bir sekilde donusturuldugunu varsayildiginda, buna genetigi degistirilmis hucreler denilebilir. Embriyoya enjekte etmek: Donusturulmus hucreleri secilir ve onlari model organizmanin gelismekte olan embriyosuna yerlestirilir. Normal sekilde buyumesine izin verilir. Model fare secimi: Model organizmanin embriyosunda iki tur hucre populasyonu vardir, biri vahsi tip ve digeri degistirilmis (donusturulmus) hucreler, bu hayvana kimerik denir. Kimerik hayvan genetik olarak degistirilmis durumdadir, bir sonraki adimda, onu iki farkli genotipin yavrularini ureten normal hayvanla ciftlestirilir ve biri homozigot normal veya homozigot degistirilmis genotipe sahip baska bir hayvan (ve ayni zamanda heterozigot) elde edilir. Sonuc: Artik gen nakavt hayvani insa edilmis durumdadir ve bilim adamlari onu ilgilenilen genle ilgili farkli parametreleri olcmek icin inceleyebilirler. Genle ilgili fiziksel, biyokimyasal veya genetik parametreler incelenebilir. Bundan sonra, PCR amplifikasyon yontemi kullanilarak, gen nakavtinin sonuclari dogrulanabilir. Gen Nakavti Nasil Dogrulanir? Gen nakavtinin dogrulanmasi, tum deneyin cok onemli bir parcasidir. Bunu yapmak icin bircok farkli yontem kullanilsa da, gunumuzde populer yontemlerden biri, polimeraz zincir reaksiyonudur. Polimeraz zincir reaksiyonu, yaygin olarak kullanilan yontemlerden biridir ve cogu deney icin en guvenilirdir. Burada, gen nakavtini dogrulamak veya onaylamak icin iki primer seti kullanilir. Bir primer seti, hedef sekansin komsu bolgelerinden tasarlanir ve diger primer seti, markor gen sekansi, yani antibiyotik direnc geni icin tasarlanir. Deneyin onemli sonuclarindan biri hedef gen yeniden birlestirilirse, antibiyotik gen hedef genoma aktarilir. Bu nedenle, isaretleyici genin tamamlayicisi olan primer seti ile PCR reaksiyonunda DNA bandi elde edersek deneyimiz basarili olur. Diger yandan, hedef gen cikarildiktan sonra, ilgilenilen gene ozel kusatma primerleri cogaltilamaz ve DNA bandi elde edilemez. Bununla birlikte, bir kontrol reaksiyonu olarak yabani tip DNA kullanilmaktadir, boylece primer seti 1 ile bir DNA bandi elde edilebilir. Amplifikasyon reaksiyonu tamamlandiktan sonra sonuclar, agaroz jel elektroforezi kullanilarak dogrulanir. PCR’nin sonuclari % 2 agaroz jelde gorsellestirilebilir. Gen Nakavti Icin Neden Fareler Secilir? Bir genin islevini incelemek icin yaratilmis, etkisizlestirilmis ilgili gene sahip farelere nakavt fareler denir. Fareleri, insan ve fare genleri arasindaki benzerliklerden dolayi genetik muhendisligi calismalarinda ve nakavt calismalarinda kullanilmaktadir. Insan ve fare genlerinin% 99’u benzerdir, bu nedenle deney icin insan embriyosunu dogrudan kullanmak yerine fareleri kullanmak akillica bir karardir. Insan embriyo calismalari ile iliskili birkac etik sorun nedeniyle, bilim adamlari fareleri gen nakavt calismalari icin kullanilmaktadirlar.
________________
Bizde Mutsuz Olalim ~
|
|
|
| Konuyu Toplam 1 Üye okuyor. (0 Kayıtlı üye ve 1 Misafir) | |
|
|
Normal
